Y迷宮實驗

Y迷宮實驗可用于評估小鼠的短期記憶。通過允許小鼠探索迷宮的所有三個臂，可以評估自發(fā)交替行為——一種空間工作記憶的測量，這是由嚙齒動物天生想要探索以前未訪問過的區(qū)域的好奇心驅(qū)動的。一只具有完整工作記憶的小鼠，因此具有完整的前額葉皮質(zhì)功能，將記住以前訪問過的臂，并傾向于進入最近訪問較少的臂?？臻g參考記憶，由海馬支持，也可以通過在訓(xùn)練期間將試驗小鼠放入Y迷宮并關(guān)閉一個臂來測試。例如，在1小時的試驗間隔后，小鼠應(yīng)該記得它以前沒有探索過的臂，并且應(yīng)該更頻繁地訪問這個臂。本章描述了進行這兩個相關(guān)測試并解釋結(jié)果之前的條件、所需材料和協(xié)議。

一、 引言

阿爾茨海默病是最常見的癡呆形式，其特點是認(rèn)知功能的逐漸衰退。據(jù)估計，它影響了超過60歲年齡組的6-8%的個體。臨床前的小鼠模型在測試癡呆和認(rèn)知障礙的潛在病理生理學(xué)以及篩選和開發(fā)新藥治療方面已被證明是有用的。本章描述了兩種行為測試，用于檢測工作記憶和參考記憶，可以使用同一設(shè)備——一個封閉的Y迷宮來進行。

基于其設(shè)計基礎(chǔ)，Y迷宮可用于評估小鼠的短期記憶。例如，自發(fā)交替，一種測量空間工作記憶的方法，可以通過允許小鼠自由探索迷宮的所有三個臂來評估，這種行為是由嚙齒動物探索以前未訪問過的區(qū)域的天生好奇心驅(qū)動的。一個具有良好工作記憶的小鼠將記得它已經(jīng)訪問過的迷宮的臂，并將傾向于進入最近訪問較少的臂。這需要大腦的幾個不同區(qū)域，如海馬和前額葉皮質(zhì)之間的互動。測試是使用一個Y形迷宮進行的，迷宮有三個淺色的、不透明的臂，它們以120°的角度相互定位。小鼠在迷宮上的特定位置引入，并允許在短時間內(nèi)自由探索臂。當(dāng)小鼠的所有四肢都在一個臂內(nèi)時，認(rèn)為發(fā)生了進入臂的行為。交替定義為連續(xù)并且不重復(fù)的進入所有三個臂。然后，記錄臂入口和交替的次數(shù)，以計算交替行為的百分比。高百分比被視為良好的工作記憶，因為這表明小鼠已經(jīng)回憶起它已經(jīng)訪問過的臂。

空間參考記憶可以通過在訓(xùn)練期間將測試小鼠放入Y迷宮并關(guān)閉一個迷宮臂來測試（訓(xùn)練協(xié)議）。這個臂被為新穎臂。在一定的時間間隔（試驗間隔，ITI）后，期間將小鼠從迷宮中移除，然后在移除障礙物后將小鼠重新放入迷宮（測試協(xié)議）。ITI的長度將強烈影響動物在這項任務(wù)中的表現(xiàn)，因為較長的ITI需要更高的記憶負(fù)載。常用的小鼠品種通常在最多4小時的ITI下在這項任務(wù)中表現(xiàn)良好。一些研究者使用24小時的ITI來探索長期空間記憶。小鼠應(yīng)該基于遠端空間線索及其與Y迷宮中自己當(dāng)前位置的關(guān)系，記住它以前沒有探索過的臂，并且應(yīng)該比其他臂更頻繁地訪問這個新穎臂。然后將進入新穎臂的次數(shù)與進入其他臂的次數(shù)進行比較，以評估空間記憶的程度。在測試會議期間，對任何臂都沒有偏好的小鼠表示空間記憶受損，這可能表明海馬功能受損。

二、實驗材料

1.實驗和對照小鼠（見注釋1）。

2.稱重秤。

3.測試室及相鄰操作員座位的房間（見注釋2）。

4.淺灰色聚氯乙烯（PVC）Y形隔間（21 × 7 × 15.5厘米），三個臂長相等（圖1）。

5.用來阻擋迷宮一臂的隔板。

6.迷宮周圍的三個視覺線索標(biāo)志物（見注釋3）。

7.容器裝Y迷宮，以防老鼠逃跑。

8.攝像頭/相機（見注釋4）。

9.支架用來將攝像頭放置在迷宮上方的較高位置。

10.visutrack行為學(xué)分析軟件（見注釋5）。

11.噴霧瓶裝有70%的乙醇和紙巾（見注釋6）。

三、實驗前的準(zhǔn)備

1.實驗前至少7天讓小鼠適應(yīng)，以便所有動物熟悉房間、工作人員、氣味和噪音（見注釋7）。

2.在行為學(xué)研究的早上稱量小鼠并記錄信息，包括研究標(biāo)題和小鼠品系。

3.使用乙醇噴霧瓶和紙巾確保Y迷宮在測試前清潔。

4.清潔后確保迷宮干燥。

5.將攝像頭放置在Y迷宮上方的支架上，并通過延長USB線纜連接到電腦（見注釋8）。

6.在測試前1小時將小鼠放入行為測試室中，讓它們適應(yīng)條件。

四、 短期記憶的測試——自發(fā)性交替

1.標(biāo)記迷宮的三個臂為A、B和C。

2.讓行為學(xué)軟件與Y迷宮相機連接成功并調(diào)整清晰度，全面的拍攝到迷宮里的老鼠。

3.將測試動物放置在標(biāo)有A的臂的遠端，面向迷宮中心，輕輕地抓住尾巴的基部。

4.離開測試室。

5.讓小鼠自由探索迷宮5/8/10分鐘。

6.停止錄像并保存文件。

7.將小鼠從迷宮中取出，放回原籠。

8.在進行下一個動物之前，清潔迷宮的所有墻壁和地面。

9.實驗結(jié)束并測試了所有的小鼠后，將所有小鼠放回保持室中的家籠。

10.清潔所有設(shè)備并收拾好。

11.檢查視頻并記錄所有進入臂的次數(shù)和交替次數(shù)（見注釋9）。

12.使用以下公式計算百分比（%）交替：

五、 空間參考記憶測試——新穎臂測試

1.小鼠適應(yīng)期后，如上述標(biāo)記迷宮的三個臂為A、B和C。

2.用隔板關(guān)閉其中一個臂（圖2）（見注釋10）。記錄哪個臂被關(guān)閉。

3.通過USB采集卡纜將攝像頭連接到電腦并開始錄像（見注釋8）

4.將動物面向中心放入一個開放的臂中，并記錄動物被放置在哪個臂（見注釋11）。

5.離開行為測試室。

7.按下visutrack軟件的的開始分析鍵，并計時15分鐘。

8.讓動物自由探索迷宮15分鐘。

9.15分鐘后，停止錄像。

10.將測試小鼠返回其飼養(yǎng)籠。

11.移除隔板。

12.等待1小時（或預(yù)設(shè)的ITI所需的時間長度）并再次開始錄像。

13.用VisuTrack設(shè)置定時器為5分鐘。

14.將相同的測試小鼠放置在之前試驗中使用的同一臂的遠端，面向迷宮中心。

15.離開測試室并按下定時器的開始鍵。

16.讓動物自由探索迷宮5分鐘。

17.停止錄像并保存文件。

18.將小鼠從迷宮中取出，放回家籠。

19.在進行下一個動物之前，清潔迷宮的所有墻壁和地面。

20.實驗結(jié)束時，將所有小鼠返回保持室，清潔所有設(shè)備并收拾好。

21.使用Visutrack軟件分析測試期間進入所有臂的總行走距離。

22.識別迷宮的起點、新穎的臂和其他臂，并記錄每個臂的進入次數(shù)以及在每個臂中停留的時間（見注釋12）。

六、注釋

1.選擇的小鼠種類應(yīng)該能代表認(rèn)知或記憶障礙/增強的某個方面，例如慢性應(yīng)激模型、加速衰老的遺傳模型或潛在記憶增強藥物的測試。最重要的是，所有程序應(yīng)得到相應(yīng)機構(gòu)的批準(zhǔn)。

2.使用單獨的房間很重要，因為它最小化了操作者干預(yù)或?qū)y試結(jié)果產(chǎn)生不當(dāng)影響的可能性。在此基礎(chǔ)上，測試期間設(shè)施內(nèi)的環(huán)境噪音應(yīng)盡量減少。同樣重要的是，動物保持區(qū)域內(nèi)也應(yīng)滿足此條件，因為噪音可能會增加動物的壓力水平，并導(dǎo)致認(rèn)知障礙。

3.這些可以是圓形和方形的圖片，用來幫助老鼠識別與新奇性相關(guān)聯(lián)的迷宮臂。確保作為遠距離空間線索的物體在實驗過程中不會移動。

4.使用攝像頭是為了能遠程觀察所有情況。同樣，這有助于最小化直接觀察者可能對測試結(jié)果產(chǎn)生的不當(dāng)影響。

5.用于分析動物行為的軟件。也可以使用其他軟件，但操作者應(yīng)確保所需的輸出測量值包含在其特性中。

6.這僅僅是為了在測試運行前和期間清潔迷宮，因為殘留的氣味和物質(zhì)可能會影響測試結(jié)果。

7.同樣，這是所有行為學(xué)研究中應(yīng)采取的步驟，以減少動物的壓力，從而提高研究結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。此外，至少在行為測試前24小時，設(shè)施內(nèi)不應(yīng)進行動物的淘汰或采血。在整個行為測試過程中應(yīng)保持低環(huán)境噪音。

8.在電腦屏幕上檢查圖像時，確保可以看到迷宮的所有區(qū)域。

9.如果老鼠用全部四只爪子進入迷宮的一個臂（A、B或C），則記錄為一次進入。交替定義為老鼠連續(xù)進入所有三個臂。為了識別自發(fā)交替，使用了重疊技術(shù)。例如，A–C–B–C–A的模式包含兩次交替。

10.用于阻塞的臂應(yīng)隨機選擇，并在小鼠間輪換。

11.這也應(yīng)在不同的運行和測試小鼠之間隨機化。

12.具有完整空間參考記憶的老鼠應(yīng)該進入并在新奇臂中花費的時間比迷宮的其他臂多。然而，我們和其他人注意到，小鼠在研究初期傾向于在起始臂逗留，因此這個臂可能被排除在比較基準(zhǔn)之外?？臻g參考記憶受損的小鼠將無法識別新奇臂，因為它們無法回憶起在研究預(yù)運行階段哪個臂被阻塞。記憶受損表現(xiàn)為對新奇臂和其他臂的區(qū)分缺失。